生物實驗室利用液氮罐進(jìn)行大鼠肝S9的制備和蛋白

1 實驗?zāi)康?br /> 學(xué)會大鼠肝S9的制備及其蛋白含量的測定。

2 實驗材料與方法
2.1實驗動物
大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周 齡，150g左右
2.2試劑
1.17% （0.15M） KCl、苯巴比妥鈉、戊巴比妥鈉、多氯聯(lián)苯、β-萘黃酮    
Tris-HCl緩沖液：6.05g Tris加約800ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調(diào)pH值至7.4，最后用蒸餾水定容至1000ml
2.3器材
低溫高速離心機(jī)、潔凈工作臺、勻漿器、注射器、手術(shù)剪、低溫冰箱、MVE液氮罐等
2.4 實驗操作
2.4.1試劑的配制
（1）Tris-HCl緩沖液：6.05g Tris加約80ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調(diào)pH值至7.4，最后用蒸餾水定容至1000ml
（2）考馬斯亮蘭G-250染料：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸餾水稀釋至1升，濾紙過濾。
2.4.2肝S9的制備
（1）誘導(dǎo)   苯巴比妥鈉80mg/kg， 腹腔注射，連續(xù)3～5d，最后一次給藥后24h后采樣。
（2）采樣   采樣前禁食24h，但可以自由飲水；斷頭處死；無菌取出肝臟，置平皿中稱重，用預(yù)冷的0.15M  KCl溶液淋洗數(shù)次，以便除去能抑制微粒體酶活性的血紅蛋白。
（3）肝勻漿的制備   棄去淋洗液，將肝臟轉(zhuǎn)入小燒杯，加 Tris-HCl緩沖液溶液     3mL/g （肝濕重），轉(zhuǎn)入冰浴，用剪刀剪碎肝臟，轉(zhuǎn)入勻漿器勻漿。
（4）制備S9    將肝勻漿于低溫高速離心機(jī)0～4℃ 000g  離心  10min上清液即為S9。
（5）分裝保存   將制備好的S9于無菌冷凍管或安瓿中保存，每個安瓿2mL左右。于MVE液氮罐速凍后置-80℃低溫保存。深低溫或冰凍干燥，保存期不超過一年。

2.5蛋白含量測定（考馬斯亮蘭染色法）
2.5.1測定原理
 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)（主要是堿性氨基酸，特別是精氨酸和芳香族氨基酸殘基）結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。染料在595nm下測定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比。
2.5.2特點
（1）靈敏度高，比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)0.5 mg
（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。
（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
2.5.3試劑與器材
試劑：
標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：1mg/ml牛血清清蛋白（BSA）
考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸餾水稀釋至1升，濾紙過濾。
Tris-HCl緩沖液： 6.05g Tris加約80ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調(diào)pH值至7.4，最后用蒸餾水定容至1000ml（0.05M）
2.5.4操作方法
微量法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線
按下表加樣，混勻，室溫靜置5-10min，以0號試管為空白對照，于595nm處比色測定吸光度，平行測定三次。95nm處吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表一：測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的試樣
樣品編號    0    1    2    3    4    5    6
標(biāo)準(zhǔn)血清溶液（ug）
標(biāo)準(zhǔn)血清溶液（ml）
蒸餾水（ml）    0
0
0.1    10
0.01
0.09    20
0.02
0.08    40
0.04
0.06    60
0.06
0.04    80
0.08
0.02    90
0.1
0
考馬斯亮蘭試劑（ml）    5.0

肝S9蛋白質(zhì)濃度的測定
測定方法同上，分別取肝S9組分10倍稀釋液20mL、30mL、40mL，按下表加樣，測595nm的吸光度值，平行測定三次。根據(jù)所測定的平均值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)。


表二：待測蛋白的試樣
樣品編號    0    1    2    3
上清液（ml）
蒸餾水（ml）    0
0.1    0.02
0.08    0.03
0.07    0.04
0.06
考馬斯亮蘭試劑（ml）                   5.0





3 實驗結(jié)果
表三：準(zhǔn)曲線管的吸光度值
試樣    1          2         3         4           5         6  
一    0.012    0.087      0.209     0.330      0.465      0.630
二    0.062    0.084      0.245     0.360      0.472      0.600
三    0.085    0.100      0.258     0.380      0.445      0.620
平均值    0.053    0.090      0.237     0.357      0.461      0.617

圖一：蛋白質(zhì)濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
 

 表四： 稀釋液樣品吸光度值
試樣    1                2            3       
一    0.255    0.439        0.520   
二    0.208    0.280        0.466   
三    0.195    0.435        0.690   
平均值    0.220    0.385        0.559  

利用軟件讀出稀釋液樣品的蛋白分別為0.038、0.066、0.095。
算出三次取樣的上清液濃度分別為19 mg/ml、22 mg/ml、24 mg/ml，取平均值得蛋白質(zhì)的濃度為21.7 mg/ml。


4討論
肝臟微粒體中含有多種酶系統(tǒng),是許多藥物、殺蟲劑、除草劑、污染物及食物添加劑等外源性高脂溶性物質(zhì)在體內(nèi)的主要生物轉(zhuǎn)化場所,也稱為肝微粒體藥物代謝酶,簡稱為肝藥酶。該酶系統(tǒng)底物面廣,活性個體差異大,影響活性因素多。其中最重要的是混合功能氧化酶系統(tǒng),可催化許多不同型的氧化反應(yīng),如羥基化,烷基化,脫氨基化,脫鹵素,硫原子氧化等。該酶系統(tǒng)中一個主要成分是細(xì)胞色素P450,是由與一氧化碳結(jié)合后,在光譜450nm處有吸收峰而得名。細(xì)胞色素P450含量高低反映了混合功能氧化酶系統(tǒng)活性的高低,這個系統(tǒng)將分子氧中一個氧原子氧化藥物,另一個氧原子生成水,沒有產(chǎn)生相應(yīng)的還原物,故也稱為細(xì)胞色素單加氧酶。肝S9主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是一個酶系統(tǒng)。
    肝微粒體酶的制備需在無菌條件下操作，制備之后要用液氮速凍后置-80℃低溫保存。凍干法是生物化學(xué)、生物制劑和微生學(xué)用以保持某些蛋白質(zhì)、酶類和原核生物活性的較好方法之一。保持肝的代謝活性, 實質(zhì)上就是要保持肝內(nèi)微粒體膜上的酶類的活性。因此, 用凍干法保持肝的代謝活性。本次實驗過程肝S9制備好以后直接用于測定因此沒有進(jìn)行凍干儲存的步驟。